Tässä elokuvassa Mario ja Luigi ratkovat arkisia pulmia Sienivaltakunnassa rennolla aseenteella. He saavat Yoshista uuden ystävän, yrittävät saada pikku Bowseria parantamaan tapansa ja odottavat innolla Peachin syntymäpäiviä. Avunpyyntö lähettää heidät kuitenkin toiselle puolelle galaksia kohtaamaan uusia maailmoja, odottamattomia vaaroja sekä unohtumattomia hahmoja kuten Rosalina ja Bowser Jr.